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Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät - Jahrgang 2008

 

Titel Allosterisch/orthosterische Hybridliganden des muskarinischen Acetylcholinrezeptors
Rezeptorbindung und -aktivierung
Autor Kerstin Kellershohn
Publikationsform Dissertation
Zusammenfassung In Bezug auf die allosterische Bindungsstelle G-Protein-gekoppelter Rezeptoren sind muskarinische Acetylcholinrezeptoren die am besten untersuchte Rezeptor-Familie. Da die meisten allosterischen Modulatoren die höchste Affinität zum M2-Rezeptor aufweisen, stand dieser Subtyp im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit. Die räumliche Nähe der im Bereich der extrazellulären Schleifen angesiedelten allosterischen Bindungsstelle zum orthosterischen Haftareal, das sich im oberen Drittel der transmembranären Domänen befindet, führte zur Entwicklung sogenannter Hybridliganden. Diese entstanden durch kovalente Verbindung eines orthosterischen, muskarinischen Antagonisten oder Agonisten mit einem wesentlichen Strukturelement der zu den Alkan-Bisammonium-Verbindungen gehörenden allosterischen Antagonisten W84 oder Naphmethonium. Durch die Hybridbildung sollte eine Überbrückung beider Bindungsstellen ermöglicht und so dem orthosterischen Liganden zu einer besseren Haftung am Rezeptor und einer höheren Subtypselektivität verholfen werden.
In einer vorangegangenen Arbeit hatte sich gezeigt, dass Hybride aus dem muskarinischen Antagonisten AF-DX 384 und unterschiedlich langen Strukturelementen von W84 nicht die Affinität der Muttersubstanz AF-DX 384 zum freien M2-Rezeptor erreichten (M. Mohr, (2004) Dissertationsschrift Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn). Daher wurde postuliert, dass diese Hybride in der allosterischen Bindungsstelle festgehalten wurden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte in Radioligandbindungsstudien an Herzventrikelgewebe des Hausschweins mit [3H]NMS als Sonde untersucht werden, welche Bindungseigenschaften ein Hybrid mit einer verlängerten Zwischenkette innerhalb der AF-DX 384-Struktur besaß. Dabei zeigte sich, dass dieses Hybrid eine um mehr als eine Dekade höhere Affinität zum M2-Rezeptor aufwies, als vorher für das analoge Hybrid gefunden wurde. Somit führte die Kettenverlängerung zu einer besseren Überbrückung der allosterischen und orthosterischen Bindungsstelle.
Im Hauptteil dieser Arbeit wurden Hybride getestet, in denen unterschiedliche Oxotremorin-M-artige Agonisten kovalent mit einem konstanten Strukturanteil von W84 oder Naphmethonium verknüpft waren. Da die Hybride eine agonistische und eine antagonistische Strukturkomponente vereinigten, waren [35S]GTPγS-Bindungsexperimente an Membransuspensionen aus stabil mit dem M2-Rezeptor-Gen transfizierten CHO-Zellen ein geeignetes Versuchssystem, um die Fähigkeit dieser Verbindungen bezüglich der Rezeptoraktivierung zu untersuchen. Bei keinem der getesteten Hybride kam es durch die allosterische Komponente zu einer vollständigen Auslöschung der intrinsischen Aktivität. Es konnten zwei vollagonistische Hybride identifiziert werden, die sich von dem sehr aktiven Oxotremorin-M-Derivat Iperoxo ableiteten. Allerdings kam es durch die Hybridbildung zu einer signifikanten Verminderung der Wirksamkeit (pEC50) im Vergleich zur Muttersubstanz Iperoxo. Hybride, die entweder die Oxotremorin-M-Struktur selbst oder weitere Derivate davon enthielten, wurden als Partialagonisten identifiziert. Die Verkürzung eines von Iperoxo abgeleiteten Hybrids um zwei Methylengruppen hatte keinen Einfluss auf die intrinsische Aktivität (Emax) und die Wirksamkeit. Hingegen führte eine umfassendere Verkürzung um sechs Methylengruppen und einen quartären Stickstoff zu einer starken Verminderung der intrinsischen Aktivität.
In Interaktionsexperimenten wurden die allosterischen Liganden W84 und Naphmethonium sowie der orthosterische Ligand Atropin als Werkzeuge zur Definition des allosterischen bzw. orthosterischen Haftareals eingesetzt. Die Interaktion der Hybride mit den allosterischen Liganden ergab einen Hinweis, dass die Hybride an das allosterische Haftareal binden. Die Interaktion mit Atropin lässt die Schlussfolgerung zu, dass die Hybride den Rezeptor über die orthosterische Bindungsstelle aktivieren.
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© Universitäts- und Landesbibliothek Bonn | Veröffentlicht: 2008