| Titel | Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zur Funktion von DsrN und DsrL im dissimilatorischen Schwefelstoffwechsel von Allochromatium vinosum |
| Autor | Yvonne Lübbe |
| Publikationsform | Dissertation |
| Zusammenfassung | Die im dsr-Operon kodierten Proteine des phototrophen Schwefelbakteriums Allochromatium vinosum sind in die Oxidation akkumulierten Schwefels
involviert. Zwei dieser Proteine, DsrN und DsrL, wurden in dieser Arbeit näher
charakterisiert. Aus pho-tolithoautotroph angezogenen A. vinosum-Zellen
und auch aus dem Enzym Sulfitreduktase (DsrAB) wurde das Tetrapyrrol Siro(häm)amid
isoliert. Dies zeigt, dass Siro(häm)amid die prosthetische Gruppe der reversen
dissimilatorischen Sulfitreduktase in A. vinosum ist. Dieser Nachweis
bestätigt die aufgrund von Sequenzhomologien postulierte Funktion von DsrN als
Sirohäm-Amidase. Eine "in frame"-Deletion von dsrN führt zu einer signifikant
verlangsamten Schwefeloxidation, die durch Komplementation mit dsrN wieder
aufgehoben werden kann. DsrN ist folglich für die Schwefeloxidation in A.
vinosum nicht essentiell, aber für eine effiziente Oxidationsreaktion notwendig.
Spektroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Sulfitreduktase der Mutante
Sirohäm enthält. Die fehlende Amidgruppe der prosthetischen Gruppe führt wahrscheinlich
zu einer geringeren Aktivität der Sulfitreduktase und damit zu der beobachteten
verlangsamten Schwefeloxidation der Mutante. Das dsrN-Gen ist sowohl
in Sulfat/Sulfitreduzierern als auch in Schwefeloxidierern weit verbreitet.
Dies deutet auf eine wichtige Funktion des Proteins im dissimilatorischen Schwefelstoffwechsel
hin und lässt vermuten, dass in den meisten, wenn nicht allen am Energiestoffwechsel
beteiligten Sulfitreduktasen, Siro(häm)amid die prosthetische Gruppe ist. Das DsrL-Protein konnte rekombinant aus E. coli aufgereinigt werden. Es bildet verschiedene Multimere und enthält 1 Mol FAD pro Mol DsrL-Monomer, die vermuteten Eisen-Schwefel-Cluster konnten nicht detektiert werden. Die für DsrL postulierte Glutamatsynthaseaktivität konnte nicht bestätigt werden. Sowohl für das rekombinante als auch für das native DsrL aus A. vinosum konnte jedoch über den Nachweis der Diaphoraseaktivität eine Funktion als elektronentransportierendes Enzym mit NADH als Elektronendonor gezeigt werden. Natives DsrL wurde zusammen mit der Sulfitreduktase aus A. vinosum aufgereinigt. Die Proteine bilden einen DsrA2B2L2-Komplex, der sowohl nach Gelfiltration als auch nach Auftrennung über native Polyacrylamidgelelektrophorese stabil ist. Freies DsrL aus A. vinosum liegt als Homodimer vor. Die "in frame"-Deletion des dsrL-Gens führt zu einer kompletten Hemmung der Schwefeloxidation, die durch Komplementation mit dsrL wieder aufgehoben werden kann. DsrL ist demnach essentiell für die Oxidation akkumulierten Schwefels. Da DsrL bisher nur in schwefeloxidierenden Bakterien nachgewiesen werden konnte, wird eine essentielle Funktion des Proteins in Zusammenhang mit der umgekehrten Sulfitreduktasereaktion vermutet. In Verbin-dung mit den erhaltenen Ergebnissen konnte damit ein neues Modell zur Funktion von DsrL im oxidativen Schwefelstoffwechsel von A. vinosum erstellt werden. |
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